A. Pengertian
Spektrofotometri
merupakan salah satu metode
dalam kimia analisis yang digunakan untuk menentukan komposisi suatu sampel
baik secara kuantitatif dan kualitatif yang didasarkan pada interaksi antara
materi dengan cahaya.
Cahaya yang dimaksud dapat berupa cahaya visibel, UV dan inframerah, sedangkan
materi dapat berupa atom dan molekul namun yang lebih berperan adalah elektron
valensi.
B.
Komponen Utama Spektrofotometri
1.
Sumber Cahaya
2.
Pengatur Intensitas
3.
Monokromator
4.
Kuvet
5.
Detektor
6.
Penguat (amplifier)
C. Hukum
Lambert-Beer
Berdasarkan hukum Lambert-Beer,
rumus yang digunakan untuk menghitung
banyaknya cahaya yang dihamburkan:
Dan absorbansi
dinyatakan dengan rumus:
Dimana I0 merupakan
intensitas cahaya datang dan It atau I1 adalah
intensitas
cahaya setelah melewati sampel.
Rumus yang diturunkan dari Hukum
Beer dapat ditulis sebagai:
Dimana:
A = Absorbansi
a = Tetapan absorbtivitas (jika konsentrasi
larutan yang diukur dalam ppm)
c = Konsentrasi larutan yang diukur
ε = Tetapan absorbtivitas molar
(jika konsentrasi larutan yang diukur dalam
ppm)
b atau terkadang digunakan l = Tebal
larutan (tebal kuvet diperhitungkan juga
umumnya 1cm)
Secara eksperimen hukum Lambert-beer akan terpenuhi apabila peralatan
yang digunakan memenuhi kriteria-kriteria berikut:
1.
Sinar
yang masuk atau sinar yang mengenai sel sampel berupa sinar dengan dengan
panjang gelombang tunggal (monokromatis).
2.
Penyerapan
sinar oleh suatu molekul yang ada di dalam larutan tidak dipengaruhi oleh
molekul yang lain yang ada bersama dalam satu larutan.
3.
Penyerapan
terjadi di dalam volume larutan yang luas penampang (tebal kuvet) yang sama.
4.
Penyerapan
tidak menghasilkan pemancaran sinar pendafluor. Artinya larutan yang diukur
harus benar-benar jernih agar tidak terjadi hamburan cahaya oleh
partikel-partikel koloid atau suspensi yang ada di dalam larutan.
5.
Konsentrasi
analit rendah. Karena apabila konsentrasi tinggi akan menggangu kelinearan
grafik absorbansi versus konsntrasi.
D.
Jenis-jenis Spektrofotometri Berdasarkan Sumber
Cahaya Yang Digunakan
1.
Spektrofotometri
Visible (Spektro Vis)
Pada spektrofotometri ini yang digunakan sebagai sumber sinar/energi adalah
cahaya tampak (visible). Cahaya visible termasuk spektrum
elektromagnetik yang dapat ditangkap oleh mata manusia.
Panjang gelombang sinar
tampak adalah 380 sampai 750 nm. Sehingga semua sinar yang dapat dilihat oleh
kita, entah itu putih, merah, biru, hijau, apapun, selama ia dapat dilihat oleh mata, maka sinar
tersebut termasuk ke dalam sinar tampak (visible).
Sumber sinar tampak yang umumnya dipakai pada spektro visible adalah
lampu Tungsten. Tungsten yang dikenal juga dengan nama Wolfram
merupakan unsur kimia dengan simbol W dan no atom 74. Tungsten mempunyai titik
didih yang tertinggi (3422 ºC) dibanding logam lainnya. karena sifat inilah
maka ia digunakan sebagai sumber lampu.
Sampel yang dapat dianalisa dengan metode ini hanya sample yang memiliki warna. Hal ini menjadi kelemahan
tersendiri dari metode spektrofotometri visible. Oleh karena itu, untuk sample yang
tidak memiliki warna harus terlebih dulu dibuat berwarna dengan menggunakan
reagent spesifik yang akan menghasilkan senyawa berwarna. Reagent yang
digunakan harus betul-betul spesifik hanya bereaksi dengan analat yang akan
dianalisa. Selain itu juga produk senyawa berwarna yang dihasilkan harus
benar-benar stabil. Salah satu contohnya adalah pada analisa kadar
protein terlarut (soluble protein). Protein terlarut dalam larutan tidak
memiliki warna. Oleh karena itu, larutan ini harus dibuat berwarna agar dapat
dianalisa. Reagent yang biasa digunakan adalah reagent Folin. Saat
protein terlarut direaksikan dengan Folin dalam suasana sedikit basa, ikatan
peptide pada protein akan membentuk senyawa kompleks yang berwarna biru yang
dapat dideteksi pada panjang gelombang sekitar 578 nm. Semakin tinggi
intensitas warna biru menandakan banyaknya senyawa kompleks yang
terbentuk yang berarti semakin besar konsentrasi protein terlarut dalam sample.
2.
Spektrofotometri Ultraviolet (UV)
Berbeda dengan spektrofotometri visible, pada spektrofotometri UV
berdasarkan interaksi sample dengan sinar UV. Sinar UV memiliki panjang
gelombang 190-380nm. Sebagai sumber sinar dapat digunakan lampu deuterium. Deuterium
disebut juga heavy hidrogen. Dia merupakan isotop hidrogen yang stabil yang terdapat
berlimpah di laut dan daratan. Inti atom deuterium mempunyai satu proton dan
satu neutron, sementara hidrogen hanya memiliki satu proton dan tidak memiliki
neutron. Nama deuterium diambil dari bahasa Yunani, deuteros, yang
berarti ‘dua’, mengacu pada intinya yang memiliki dua pertikel.
Karena sinar UV tidak dapat dideteksi oleh mata kita, maka senyawa yang
dapat menyerap sinar ini terkadang merupakan senyawa yang tidak memiliki warna.
Bening dan transparan. Oleh karena itu, sample tidak berwarna tidak
perlu dibuat berwarna dengan penambahan reagent tertentu. Bahkan sample dapat
langsung dianalisa meskipun tanpa preparasi. Namun perlu diingat, sample keruh
tetap harus dibuat jernih dengan filtrasi atau centrifugasi. Prinsip dasar pada
spektrofotometri adalah sample harus jernih dan larut sempurna. Tidak ada
partikel koloid apalagi suspensi. Sebagai contoh pada analisa protein
terlarut (soluble protein). Jika menggunakan spektrofotometri visible, sample
terlebih dulu dibuat berwarna dengan reagent Folin, maka bila menggunakan
spektrofotometri UV, sample dapat langsung dianalisa. Ikatan peptide pada protein terlarut
akan menyerap sinar UV pada panjang gelombang sekitar 280 nm. Sehingga semakin
banyak sinar yang diserap sample (Absorbansi tinggi), maka konsentrasi protein
terlarut semakin besar.
Spektrofotometri UV memang lebih simple dan mudah dibanding
spektrofotometri visible, terutama pada bagian preparasi sample. Namun harus
hati-hati juga, karena banyak kemungkinan terjadi interferensi dari senyawa
lain selain analat yang juga menyerap pada panjang gelombang UV. Hal ini
berpotensi menimbulkan bias pada hasil analisa.
3.
Spektrofotometri UV-VIS
Spektrofotometri ini merupakan gabungan antara spektrofotometri UV dan
Visible. Menggunakan dua buah sumber cahaya berbeda, sumber cahaya UV dan
sumber cahaya visible. Meskipun untuk alat yang lebih canggih sudah menggunakan
hanya satu sumber sinar sebagai sumber UV dan Vis, yaitu photodiode yang
dilengkapi dengan monokromator.
Untuk sistem spektrofotometri, UV-Vis paling banyak tersedia dan paling
populer digunakan. Kemudahan metode ini adalah dapat digunakan baik untuk
sample berwarna juga untuk sample tak berwarna.
4.
Spektrofotometri Infra Red (IR)
Dari namanya sudah bisa dimengerti bahwa spektrofotometri ini berdasar
pada penyerapan panjang gelombang infra merah. Cahaya infra merah terbagi
menjadi infra merah dekat, pertengahan, dan jauh. Infra merah pada
spektrofotometri adalah infra merah jauh dan pertengahan yang mempunyai panjang
gelombang 2.5-1000μm.
Pada spektro IR meskipun bisa digunakan untuk analisa kuantitatif, namun
biasanya lebih kepada analisa kualitatif. Umumnya spektro IR digunakan untuk
mengidentifikasi gugus fungsi pada suatu senyawa, terutama senyawa organik.
Setiap serapan pada panjang gelombang tertentu menggambarkan adanya suatu gugus
fungsi spesifik.
Hasil analisa biasanya berupa signal kromatogram hubungan intensitas IR
terhadap panjang gelombang. Untuk identifikasi, signal sample akan
dibandingkan dengan signal standard. Perlu juga diketahui bahwa sample untuk
metode ini harus dalam bentuk murni. Karena bila tidak, gangguan dari gugus
fungsi kontaminan akan mengganggu signal kurva yang diperoleh.
Terdapat juga satu jenis spektrofotometri IR lainnya yang berdasar pada
penyerapan sinar IR pendek. Spektrofotometri ini di sebut Near Infrared
Spectropgotometry (NIR). Aplikasi NIR banyak digunakan pada industri pakan dan
pangan guna analisa bahan baku yang bersifat rutin dan cepat.
Dari 4 jenis spektrofotometri ini
(UV, Vis, UV-Vis dan Ir) memiliki prinsip kerja
yang sama yaitu “adanya
interaksi antara materi dengan cahaya yang
memiliki panjang gelombang tertentu”. Perbedaannya terletak pada panjang
gelombang yang digunakan.
E. Fungsi
Masing-masing Alat
1.
Sumber
sinar polikromatis berfungsi sebagai sumber sinar polikromatis dengan berbagai
macam rentang panjang gelombang. Untuk spektrofotometer:
a.
UV
menggunakan lampu deuterium atau disebut juga heavi hidrogen
b.
VIS
menggunakan lampu tungsten yang sering disebut lampu wolfram
c.
UV-VIS
menggunan photodiode yang telah dilengkapi monokromator.
d.
Infra
merah, lampu pada panjang gelombang IR.
2.
Monokromator
berfungsi sebagai penyeleksi panjang gelombang yaitu mengubah cahaya yang
berasal dari sumber sinar polikromatis menjadi cahaya monaokromatis. Jenis
monokromator yang saat ini banyak digunakan adalah gratting atau lensa prisma dan filter optik. Jika
digunakan grating maka cahaya akan dirubah menjadi spektrum cahaya. Sedangkan
filter optik berupa lensa berwarna sehingga cahaya yang diteruskan sesuai
dengan warnya lensa yang dikenai cahaya. Ada banyak lensa warna dalam satu alat
yang digunakan sesuai dengan jenis pemeriksaan.
3.
Sel
sampel berfungsi sebagai tempat meletakan sampel.
a.
UV,
VIS dan UV-VIS menggunakan kuvet sebagai tempat sampel. Kuvet biasanya terbuat
dari kuarsa atau gelas, namun kuvet dari kuarsa yang terbuat dari silika
memiliki kualitas yang lebih baik. Hal ini disebabkan yang terbuat dari kaca
dan plastik dapat menyerap UV sehingga penggunaannya hanya pada
spektrofotometer sinar tampak (VIS). Cuvet biasanya berbentuk persegi panjang
dengan lebar 1 cm.
b.
IR,
untuk sampel cair dan padat (dalam bentuk pasta) biasanya dioleskan pada dua
lempeng natrium klorida. Untuk sampel dalam bentuk larutan dimasukan ke dalam
sel natrium klorida. Sel ini akan dipecahkan untuk mengambil kembali larutan
yang dianalisis, jika sampel yang dimiliki sangat sedikit dan harganya mahal.
4.
Detektor
berfungsi menangkap cahaya yang diteruskan dari sampel dan mengubahnya menjadi
arus listrik. Syarat-syarat sebuah detektor :
a.
Kepekaan
yang tinggi
b.
Perbandingan
isyarat atau signal dengan bising tinggi
c.
Respon
konstan pada berbagai panjang gelombang
d.
Waktu
respon cepat dan signal minimum tanpa radiasi
e.
Signal
listrik yang dihasilkan harus sebanding dengan tenaga radiasi
Macam-macam detektor:
a.
Detektor
foto (Photo detector)
b.
Photocell,
misalnya CdS
c.
Phototube
d.
Hantaran
foto
e.
Dioda
foto
f.
Detektor
panas
5.
Read
out merupakan suatu sistem baca yang menangkap besarnya isyarat listrik yang
berasal dari detektor.
F.
Cara Kerja
1.
Sumber cahaya polikromatis masuk ke dalam
monokromator (disini terjadi penyebaran cahaya)
2.
Dari monokromator kemudian keluar menuju ke sel
sampel, pada sel sampel ini terjadi
proses penyerapan cahaya oleh zat yang ada dalam sel sampel (dimana cahaya yang
masuk lebih terang dibandingkan cahaya
setelah keluar)
3.
Selanjutnya cahaya ditangkap oleh detektor dan mengubahnya
menjadi arus listrik